文献分享脑膜炎病因不再难辨,mNGS快速

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感染性脑炎和非感染性脑炎在临床症状上既有差异又有重叠，早期区别正确的病因给予干预对其治疗至关重要，然而常规检测敏感性较低，且周期较长。大多数情况下只能通过临床表现、影像学以及患者的既往病史综合分析病因。近日，美国加州大学CharlesChiu团队在新英格兰医学杂志发表的“ClinicalMetagenomicSequencingforDiagnosisofMeningitisandEncephalitis”研究针对脑膜炎和脑炎患者的脑脊液（CSF）样本进行宏基因组NGS检测，提高了神经性系统感染病原的诊断能力，为临床治疗提供了依据。

研究内容

在一项为期1多的研究中，作者研究了CSF的宏基因组测序在住院患者中诊断传染性脑膜炎和脑炎的有效性。通过正交实验室测试证实了宏基因组测序后病原体的所有阳性测试。并通过临床微生物测序委员会会议上的实时电话会议与治疗医师进行后续跟踪。

入组标准：

通过腰椎穿刺（LP）筛查每日收集脑脊液（CSF）的电子病历（EMR）报告，以确定潜在的研究候选人。

纳入标准是：

1）住院的儿科或成人患者，在脑脊液采样后2周内出现脑膜炎，脑炎或脊髓炎的急性表现（或恶化）；

2）入组时缺乏诊断结果、免疫功能低下的患者和对中枢神经系统（CNS）感染的高度临床怀疑，不需要CSF炎症标志物升高的。

在年6月1日至年7月1日期间，在8个地点筛选了名患者进行审查（图1）。共有名患者符合入选标准，名患者入组，名患者完成了研究。名患者的平均年龄为39.6岁，男性占55.9%;46名患者年龄小于18岁，占22.5%。34.3%的患者为孤立性脑膜炎（70例）、63.7％为脑炎患者（例），仅有2.0％患有脊髓炎（4例）。共有86.3％的患者（名患者）出现急性病症，而其余13.7％（28名患者）出现慢性病急性加重。94.6%患者（例）医院，40.7％（83例）免疫受损。研究患者的平均住院时间为27.9天（中位值17;范围：1至），且患有严重疾病；48.5％（99名患者）入住重症监护病房（ICU）。加州大学洛杉矶分校和加州大学旧金山分校的重症患者（名患者中有69名[47.3％]）在ICU平均花费17.8天。总体30天死亡率（医院医院外）为11.3％（23名患者）。

研究方法

收集脑脊液，所有患者均签署知情同意书，提取DNA和RNA，通过宏基因组NGS方法进行测序，使用SURPI分析。检测周期从CSF样品核酸提取开始处理到完成SURPI+分析的平均检测周期为90个小时。

检测能力评估：

比较mNGS试验与常规试验的检测结果，对于通过CSF的直接检测（即非血清学）测试进行的感染性诊断，mNGS的PPA（阳性符合率）为80.0％，NPA（阴性符合率）为98.2％，而常规测试为67.5％和99.4％。

研究结果

作者在8家医院共纳入名成人和儿童患者。其中有48.5%的患者收入ICU，30天的死亡率为11.3%。共有57名（27.9%）患者诊断出58例神经系统感染（图2）。其中19例（33％）通过常规检测和宏基因组NGS诊断，26例（45％）仅通过常规检测确诊，13例（22%）只有使用宏基因组NGS的方法能够鉴别，医院的临床检测确诊，这13项诊断中有8项具有临床效果，医生调整了7例治疗。研究结果表明，尽管进行了常规检测，但仍有一部分患者未发现神经系统感染，并证明了宏基因组NGS在临床患者检测的潜在用途。

一些案例

（一）mNGS检测检出阴性样本中星状病毒：

患者女性，29岁，患有头痛和中性粒细胞性脑膜炎，51小时后转为淋巴细胞性脑脊液。在第4天出院，诊断为无菌性脑膜炎。

高通量测序结果如下：

通过mNGS检测到AstrovirusMLB2（低于报告阈值）,临床检测为阴性，且前期在实验室中并未发现该种病毒，通过重复mNGS测序也检测到该星状病毒，被诊断为星状病毒脑膜炎病例。

（二）mNGS准确找出脑膜炎真凶-热带念珠菌：

患者为7岁男孩，患有复发性B细胞急性淋巴细胞白血病。骨髓移植后，预防性卡泊芬净治疗弥漫性念珠菌热带念珠菌病的病史因发烧，畏光和嗜睡入院。

腰椎穿刺显示脑脊液细胞增多：白细胞（WBC）计数为cell/μl，95％中性粒细胞（N），3％淋巴细胞（L）和2％单核细胞（M），葡萄糖34mg/dL（正常：45-80mg/dL）和蛋白质80mg/dL（正常15-45mg/dL）。磁共振成像（MRI）结果显示，对于梗塞，中脑，右丘脑和左基底神经节的扩散受限。病毒性脑膜炎的检测，包括人类疱疹病毒（HHV）-6，HHV-7，WNV，EBV，CMV，VZV和肠道病毒，血液和CSF培养物中细菌，抗酸杆菌（AFB）和真菌都是阴性的。

治疗：静脉注射，美罗培南（改用头孢吡肟），万古霉素和卡泊芬净（转换为脂质体两性霉素和12mg/kg/天的高剂量氟康唑）。患者接受了3次额外的腰椎穿刺诊断。CSF和血清β-D-葡聚糖测试在和（正常10-40pg/mL）时升高。

传统方法诊断鉴别结果包括病毒性，分枝杆菌性和真菌性脑膜炎。

mNGS结果：

CSFmNGS测试对Candidatropicalis呈阳性反应。

治疗方案改为继续用脂质体两性霉素和高剂量氟康唑进行靶向治疗，并停用其他抗生素，最终膜炎的消退。

支持mNGS诊断热带念珠菌感染的临床证据包括：（i）弥散性念珠菌病的既往病史，（ii）升高的β-D-葡聚糖测试，和（iii）针对靶向抗真菌治疗的临床反应。此外，mNGS验证真菌28SrRNA对热带念珠菌呈阳性。由于真菌28SrRNA检测不是常规检查，因此在没有mNGS检测的情况下临床上不太可能进行诊断。

（三）mNGS检测排除合并感染：

患者为48岁男性，患有晚期HIV（CD4计数40，病毒8,拷贝/mL）和隐球菌性肺炎病史，表现为发烧，头痛，全身无力和嗜睡。入院时，发现患者血清隐球菌抗原阳性（CrAg），CSF谱为3WBC/μL，低葡萄糖（25mg/dL）和高蛋白（84mg/dL）;虽然涉及隐球菌性脑膜炎，但他的CSFCrAg和真菌培养结果为阴性，基本上排除了这种诊断。患者在住院第2天出现腹痛和感染性休克，并转入重症监护病房（ICU）。超声检查发现许多低回声肝脏肿块与活检时B细胞淋巴瘤一致。

mNGS结果：

在CSF中单独检测EBV与患有CNS的EBV相关淋巴瘤一致。未进行脑脊液细胞学检查，患者无法耐受脑MRI检查。这一发现为治疗医生提供了进行淋巴瘤化疗的保证，并提高了患者没有另外未确诊的共感染的临床信心。

支持从EBV相关淋巴瘤诊断脑炎的临床证据包括（i）脑脊液的广泛微生物检查，（ii）经证实的肝脏外周淋巴瘤，以及（iii）通过mNGS检测脑脊液中的EBV，随后通过CSFEBVPCR检测。在对EBV相关的CNS淋巴瘤进行检测时，可以对CSF中的EBV进行鉴定，但在这种情况下，mNGS以及常规检测未发现的共鉴定感染在临床上是有用的。不幸的是，患者在同一住院期间死于脓毒症和多器官衰竭。

脑膜炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，早期诊断是提高治疗效果，改善患者愈后的关键，使用mNGS的方法可以作为一种脑膜炎的辅助诊断方法，本研究评估了宏基因组NGS在诊断特发性急性脑膜炎，脑炎或脊髓炎患者的神经系统感染的临床有效性，与传统的微生物学检测同时进行。在该选定的群体中，宏基因组NGS测定法比CSF的常规直接检测测试鉴定出更多潜在的病原体。在仅通过宏基因组NGS诊断的13个样本中的8个样本中，致病病原体通过常规检测进行了检测为阴性，这一研究结果强调了宏基因组NGS的一个关键优势：它不依赖于先前选择的靶向病原体，而是能够在单次检测中筛查成千上万种潜在的致病病原。即使与常规检测结果一致（宏基因组NGS检测到32种感染中的19种），宏基因组NGS的结果也很有价值，不仅可以确保传统诊断的诊断正确，而且可以帮助检测或排除合并感染，尤其是对与免疫功能低下的患者。研究证实了宏基因组的诊断方法可以指导早期和更有针对性的神经侵袭性感染治疗，识别新出现的感染和疾病表型，并加速非感染性原因的检查和治疗。需要注意的是，临床宏基因组NGS检测的首选时间和患者人群仍有待进一步研究确定。

参考文献：

[1]WilsonM.R.,etal.Clinicalmetagenomicnextgenerationsequencingfordiagnosisofinfectiousmeningitisandencephalitis.NEnglJMed;:-