猪沙门氏菌病在患有PMWS并发感染PRR

摘要：对来自4个爆发了沙门氏菌病的农场的14头病猪进行了调查研究。这些病猪的肿大的淋巴结可以看到淋巴细胞缺失的肉芽肿炎症。通过PCR反应可以发现DNA病毒，在损害的组织中PCV2抗原可以被标记。此外，蓝耳病病毒抗原可以在在肺部被免疫标记，猪肺疫沙门氏菌在感染的猪只中被分离出来。在感染了沙门氏菌的猪只中，5只（55.6%）有沙门氏菌病和PMWS的猪同时感染了PRRSV，比单独感染沙门氏菌和PMWS(22.2%)或单独感染沙门氏菌并和PRRSV（22.2%）的要高很多。

关键词：PMWSPRRSV沙门氏菌病

近些年，PMWS被认作是引起全球性猪养殖业巨大损失的最重要的原因之一。在感染的猪只中，PMWS可以早曾淋巴细胞减少和淋巴组织的严重损伤，从而造成继发性免疫缺陷。并发性传染性病毒，例如PPV,ADV,PRRSV，都从感染了PMWS的猪只中分离了出来。人们知道实验性的同时感染了PCV2和PRRSV或者PPV的猪只中，只表现出PMWS损伤或者临床症状。

近些年来，除了PMWS之外，猪沙门氏菌病，特别是在沙门氏菌病大面积爆发后的猪肺疫，有了让人担忧的增长。PRRSV加重了这些病猪的临床症状。但是，目前为止，这些严重的临床疾病发生的原因，还没有被充分的讨论过。在目前的研究中，我们报告了四个经历了高死亡率的猪肺疫和PMWS混合感染的猪场，来确定PMWS的发生与增长的原因之间是否有一些联系。

在年与年之间，在日本千叶的4个大规模养猪场中，约为40-90日龄的断奶仔猪表现出几个月的渐行性的体重减轻，厌食，严重的呼吸困难，耳廓两边发绀，发热。腹泻并不是常见的临床症状。来自A和B农场的病猪在疾病暴发后的几个月送到了我们的实验室。来自D农场的猪只在爆发期间送到实验室。来自C农场的猪只中，有4头在爆发期间送了过来，有2头在4个月之后送了过来。

当病猪第一次被送来的时候，4个农场的猪只死亡率分别是A：4.2%，B：11.0%，C：25%，D：33.3%。在那些猪场，断奶仔猪和哺乳猪都注射了灭火的猪支原体肺炎疫苗。三个猪场（A,B,D）对哺乳期猪注射了ADV活疫苗，C猪场对哺乳期和断奶期猪都用了ADV疫苗。在主场A和C，大约60-70日龄的猪只注射了经典猪瘟病毒和猪丹毒活疫苗。猪场D对同样日龄的猪只注射了PRRSV和猪丹毒杆菌活疫苗。

来自4个农场的14只病猪（A：2，B：3，C：6，D:3）都用阿扎派隆和硫喷妥钠进行了镇静和麻醉，然后放血致死。在尸检报告中，大脑，心脏，两肺，肝脏，肾脏，空肠，回肠，结肠，和一些淋巴结包括腹股沟浅表淋巴结、下颌淋巴结、纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结等都被取下来做细菌学鉴定。剩下的器官包括淋巴结被浸泡在20%的中性福尔马林中。然后用石蜡蜡封，切成3-4微米的切片，然后用HE染色。分理处细菌的的肺脏和肝脏切片用gram法染色。用免疫组织化学方法测定含有PMWS损害的PCV2切片用Ounki等所描述的方法。用0.25%的胰蛋白酶来处理切片，从而活化抗原。切片被用猪标准血清处理之后，1：10稀释，PCV抗体用来和PCV2反应而不是PCV1，1：32稀释，用作标准抗体。免疫反应控制器由不含初期抗体的样本组成。然后，切片用SAB法进行免疫荧光染色。对于PRRSV和沙门氏菌O7抗原的SAB免疫荧光检测，肺切片用来做PRRSV抗原检测，同样，肺脏，肝脏，还有来自7头病猪（C：4，D：3）的回肠和结肠切片来检测沙门氏菌O7抗原。兔抗PRRSV抗血清，1：稀释，沙门氏菌O7血清型1:稀释，用来作为初级抗体。除了用来检测沙门氏菌O7型的切片之外，用来检测PRRSSV抗原的切片都用0.25%胰蛋白酶处理。免疫反应控制器由不含初级抗体的样本和被正常兔血清浸润的样本。每个抗原抗体反应体系都用SAB法进行免疫标记。

来自大脑，心脏，肺脏，刚脏，脾脏，肾脏，回肠，盲肠，结肠和淋巴结的样本用DHL琼脂培养基和马血培养基挑染。培养皿在37℃培育过夜。菌落从血脂培养皿上分离，细菌型用普通的API20和快速ID测试HN-20来确定。DHL琼脂培养皿上分离的沙门氏菌样菌从落进行生化检验，然后用血清型标准方法确定。病毒DNA从7头(B:3,C:4)病猪的肺脏，肝脏，脾脏，肾脏，扁桃体、腹股沟、肠系膜、下颌淋巴结用商用DNA提取试剂盒分离出。用由Hamel等设计的特定的引物（N3f:GTGAAGTGGTATTTGGGTGCCCGCTG,N4r:ATTGCTGGTAATCAAAATACTGCGGGCC’）来进行PCV的测定。用琼脂电泳来测定PCR产物，可见大小为pb的扩增子。此外三个产物被限制性酶HinfI在37摄氏度一个小时切成两个片段，pb和pb，酶切产物是PCV2基因组。产物用琼脂电泳进行分析。

在尸检报告中，在所有感染的猪只中均可见浅表淋巴结，肠系膜淋巴结，支气管淋巴结肿大。虽然在检查过的猪只中肺损伤有些不同，但是可以观察到间质水肿，出血和黄色条纹。此外，三个肺脏（21.4%，B:2,C:1）显示程度不一的出血性实变和胸腔积液和胸膜粘连。此外，来此猪场C的三个肺脏和来自猪场D的一对肺脏显示化脓性坏死性实变；在这些病变的肺脏中，有一个充满了整个小叶的弥散性小瘤，最大的直径有3毫米。再者，感染的猪只中有7头猪肝脏有坏死性出血性病灶。

在微观组织观察中发现，在14头病猪中最常见的肺损伤是不同程度的间质性肺炎，有时损伤组织会有中性细胞渗入。在肺泡和支气管中，有时会有大量的嗜中性粒细胞和组织碎屑凝固，并且会伴随着出血。此外，可见的额外的肺损伤是化脓性坏死性支气管炎（21.4%），残余脓肿（7.1%），胸膜肺炎（21.4%）。在肝脏中，14头猪中的9头中，有所谓的“副伤寒样”的出血性或和纤维素渗出性小瘤和坏死灶随机的分布在肝脏表面。Gram阴性菌经常在损伤组织中发现。另外，在十头猪的小的局灶性损害可以随意的看到有很多细胞凋亡。除去猪肝色病变，一个肝脏还显示出组织细胞和多核巨噬细胞在类似于“副伤寒”的小瘤中中度小叶周围纤维化浸润。包括淋巴结、扁桃体、脾脏和PEYER’SPATCHES在内的淋巴器官被发现有PMWS样损伤，并且主要包括轻度到中度组织细胞和多核巨噬细胞浸润和不同程度的淋巴细胞缺失。而且，在损伤组织中的组织细胞和多核巨噬细胞的细胞质中，经常可以发现嗜碱性胞质内的花絮状包涵体，并且在淋巴组织中滤泡结构的缺失经常被发现。其他的损伤包括轻微的脑膜脑炎（14.3%）、轻微的心肌炎（28.6%）、间质性肾炎（78.6%），伴随着回肠和结肠粘膜下层和粘膜层的肉芽肿损伤和嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和细胞上皮脱屑。表一总结了对14头病猪在检查部位的PCV2、PRRSV、和沙门氏菌O7型抗原免疫组织化学检测结果。

在淋巴组织和肾脏的肉芽肿损伤中的PCV2阳性抗原被标记了出来。标记最多在损伤组织的嗜碱性细胞的细胞质包涵体中被发现。在肝脏切片中，小的局灶性损害可以看到猪肝色的核被标记了出来。但是，这种标记在“副伤寒”小瘤和坏死灶中没有显示出来。

此外，在被类似于“副伤寒”小瘤中的组织细胞和巨细胞吞噬变性的细胞中发现了PCV2抗原。在肺脏中，在组织细胞的细胞质中和刺激支气管和肺泡上皮细胞中额发现了PCV2阳性抗原。在12个（85.7%）肺脏肺泡上皮细胞上发现了PRRSV阳性抗原。此外，沙门氏菌O7型阳性抗原在在细支气管和肺泡腔被发现，同样也分布在化脓性坏死性支气管肺炎的残余脓肿中。在刚脏切片中，免疫标记的细菌细胞在坏死病灶和枯否细胞中被发现。在一例病例中的回肠和结肠的中性白细胞浸润的固有层中免疫检测发现了抗原。

猪霍乱在14个病猪中的8个（57.1%）被随机的分离出。在检查过的器官中，细菌在两个实质性的器官和回肠中被分离。猪肺疫的在肝脏（75.0%）和肺脏（62.5%）的分离率明显的比在回肠（25.0%）中的要高。其他从肺脏分离的有胸膜肺炎放线杆菌（21.4%）、多杀巴斯德杆菌（14.3%）猪链球菌、（7.1%）还有从一个心脏中发现的副猪嗜血杆菌、（7.1%）。除了C农场的一头猪之外，PCV2基因组随机的在所有猪只的淋巴组织和实质性器官均能检测出。猪霍乱感染被认作是猪传染性疾病的介质，具有机会致病菌感染的特质，正如它经常被发现与经典猪瘟并发。但是，在近些年中，猪霍乱感染被认为是败血性疾病的致病因子的介质，并且在南美洲和台湾，猪从沙门氏菌病中康复后最常发现的沙门氏菌血清型。

在日本，年至年间，《动物卫生学周刊》仅在年报道了两个猪场感染了沙门氏菌病，但是相关的报道从年到年间逐渐增加到了68个猪场。周报报道了除了猪霍乱之外的很多沙门氏菌分血清型。尽管如此，从九十年代初，因为猪霍乱而引起的沙门氏菌病在日本的很多地区都有发生，而且在统计中的其他很多案例都很有可能因为猪霍乱而引起。Schwartz提出包括病毒感染在内的很多种应激因子都和猪的免疫抑制有关，而且这些因子都有可能使沙门氏菌病爆发或者加剧沙门氏菌病的爆发。Stvenson等报告提出并发PRRSV的感染造成了自然案例中患猪霍乱断奶仔猪死亡率的增加。此外，Wills等通过实验确认了PRRSV和注射地塞米松都可以加剧患有猪霍乱的猪只的临床症状。另外，PRRSV感染和猪场周围的环境和其他的感染因子的相互作用至少可以部分的解释由于PRRS而引起的疾病的不同。在目前的调查中，14头猪中的有临床上消耗和呼吸困难的12头（85.7%）被认作是PMWS损害。在实验条件下PCV2和PRRSV作为协同因子共同作用于一般的猪只中可以导致更严重的PMWS。

在日本，有许多关于PRRSV在PMWS感染猪只中的并发感染的报道。在目前的调查中，PRRSV抗原在10头感染了间质性肺炎的猪只中被免疫标记出来。一个很重要的关于PMWS的病理学发现是在淋巴组织中，一种特征性程度不一的淋巴细胞缺失，伴随着滤泡结构的丢失。病理检查所见强烈的昭示了感染了PMWS猪只的免疫抑制状态。因此，PMWS很有可能能够充分的抑制免疫功能从而因此继发感染。在目前的案例中，14头病猪中的9头由于猪霍乱而发生了败血性的沙门氏菌病。在这9头猪中，7头患有PMWS，在感染了沙门氏菌病和PMWS的7头猪中，有5头猪的肺脏中发现了PRRSV抗原。这些结果患有沙门氏菌病和PMWS同时感染PRRSV的猪只数量比感染了沙门氏菌和PMWS或者感染了沙门氏菌和PPPRV的猪的数量要多得多。我们已经知道猪霍乱通过是呼吸和胃肠道传染。在目前的案例中，只有一例的生物体和沙门氏菌血清型抗原同样从回肠被分离出来，而且在回肠和结肠中可以免疫学检测到。但是，分局Red等的报告来说，实验的胃部感染结果并不明显。可能原因是猪霍乱感染在通过胃肠道途径传播前已经通过呼吸途径安置下来。Rosell等已经报道了在凋亡的肝细胞中PCV2免疫标记。在一例病猪中，PCV2抗原在小瘤中被间质细胞或者多核巨噬细胞吞噬的变形细胞中也能发现，类似于副伤寒样的小瘤。副伤寒样的小瘤并不能被认作是含有异物型巨细胞的肉芽肿，因为他们以一小部分间质细胞坏死性肝细胞为特征。但是，当猪并发感染了猪霍乱和PMWS的时候，区别目前的损伤组织和副伤寒样的小瘤并不容易。

Okuda等曾经报道了一例以渗入和多核巨噬细胞为特征的肝组织损伤的与PCV2相关的小猪。此外，分局Rosell等报告，现在的肝损伤和PCV2感染肝脏的第二阶段类似，描述为肝门束淋巴组织细胞炎症，伴随着薄壁组织单核炎症细胞。因此，类似与副伤寒的小瘤在PMWS与猪霍乱混合感染的肝组织损伤中很难见到。因此，因为由于猪霍乱引起的白血病损伤类似于PRRSV或者PCV2引起的间质性肺炎，而且猪霍乱引起的肝损伤与与PCV2引起的肝损伤相似，因此需要应用免疫组织化学技术来获得确切的诊断。自从Harding在加拿大发现了PMWS之后，它就被认做是一种最新的猪传染性疾病。很多归于PRRSV的病理特征可以归于PCV2感染。此外，表现临床衰竭综合征的病猪，也可以被认做是PMWS。

Hirose等在年报道了一列关于PRRS的病例，据此，我们进行了病理学和免疫组织化学分析。淋巴器官显示了特有的PMWS损伤，肾脏的组织细胞中可以免疫标记出PCV2抗原（未完成统计）。我们总结如下：在90年代，很有可能有很多沙门氏菌病与PRRSV并发的案例被诊断为了PMWS。

在当前的调查研究中，沙门氏菌感染患有PMWS的猪只并且并发感染PRRSV的情况与Wills等报道的实验案例情况非常相似。因此，PMWS之后感染PRRSV的时候，PMWS的免疫抑制状态可能扮演了一个加剧猪沙门氏菌病的角色。另外一方面，临床表现正常的带病猪只可能对疾病的控制带来困难。当从感染了猪霍乱的猪场的带毒猪转到了另一个有PMWS或者PRRSV的猪场，那么，由于带毒猪会排出少量带有猪霍乱的粪便，没有免疫猪霍乱的猪感染后将会有一个很高的死亡率。

致谢：作者想要感谢M.Haritni先生，国家动物健康协会，为他们提供了抗PCV血清并且在年协作对一例PRRS进行了免疫染色，染色的结果已经有Hirose等发表。